IF=20.4! 山东大学团队开发体内CAR-Tfh重编程策略，恢复自身免疫性肝炎免疫耐受

自身免疫性肝炎（AIH）是一种由免疫系统攻击肝细胞导致的慢性炎症性疾病，临床治疗长期依赖大剂量免疫抑制剂，但停药后易复发，且可能进展至肝衰竭需要移植。在AIH发病机制中，滤泡辅助T细胞（Tfh）的过度活化起着核心作用：Tfh驱动生发中心形成，促进B细胞产生高亲和力自身抗体，最终导致持续的肝细胞损伤。然而，Tfh细胞在病理条件下的可塑性为治疗提供了新思路——能否将这群“致病者”改造为“调节者”？

近年来，嵌合抗原受体（CAR）改造的调节性T细胞（CAR-Treg）在自身免疫病中显示出潜力，但传统CAR-Treg疗法面临体外扩增困难、组织靶向性不足、炎性微环境中表型不稳定等挑战。此外，对于由Tfh-B细胞轴驱动的疾病，直接靶向Tfh细胞可能更具优势。然而，Tfh细胞在体内数量稀少，分离和体外扩增极其困难，限制了其临床应用。

针对这一瓶颈，山东大学药学院姜新义教授团队联合齐鲁医院李涛教授、荆卫强教授等，在期刊《Cell Stem Cell》上发表了题为In vivo CAR-Tfh cell reprogramming restores tolerance in a mouse model of autoimmune hepatitis的文章，开发了一种基于氨基酸衍生脂质纳米颗粒（LNP）的体内Tfh重编程策略，实现了在体将Tfh细胞转化为表达Foxp3和CYP2D6特异性CAR的调节性Tfh细胞（CAR-Tfh）。

研究思路

研究团队从以下几个层面展开：

1.LNP载体设计与优化：基于色氨酸衍生物合成可电离脂质，通过微流控技术制备LNP，筛选出对Tfh细胞具有高效转染且低毒性的配方（TLNP），并进一步用抗CXCR5抗体修饰实现Tfh细胞靶向（RLNP），或用Tween-20修饰实现淋巴结靶向（Tw/RLNP）。

2.CAR-Tfh工程化设计：构建编码抗CYP2D6 CAR和Foxp3的自我扩增RNA（saRNA），并替换5‘UTR为CD28的UTR序列，以实现Tfh细胞特异性高效翻译。

3.体外功能验证：将RLNP转染的Tfh细胞与Tconv或B细胞共培养，评估其抗原依赖性抑制能力及细胞因子分泌。

4.体内生成与疗效评估：在AIH-II型小鼠模型（Ad-2D6诱导）中，静脉注射Tw/RLNP，检测CAR-Tfh在淋巴结和肝脏的生成及其对肝损伤、免疫细胞浸润、自身抗体和炎症因子的改善作用，并与传统免疫抑制剂（泼尼松龙、布地奈德、硫唑嘌呤）比较。

5.持久性分析：通过单细胞RNA测序评估治疗后6周肝脏免疫微环境的重塑。

关键结果

Tw/RLNP实现体内CAR-Tfh细胞的高效生成

该图系统展示了如何通过优化LNP配方实现Tfh细胞在体靶向和CAR-Tfh的生成。

首先，图A示意AIH-II模型的建立方法：通过高压尾静脉联合腹腔注射表达人CYP2D6的腺病毒（Ad-2D6），诱导肝细胞表达CYP2D6抗原，并产生自身免疫应答。图B显示，模型小鼠血清中抗CYP2D6的IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM抗体显著升高，证实自身抗体产生。图C的组织学染色（H&E和天狼星红）显示，模型小鼠肝组织出现明显的淋巴细胞浸润和胶原沉积，符合AIH病理特征。图D-F进一步证实模型小鼠血清转氨酶（ALT、AST）和碱性磷酸酶（ALP）显著升高，提示肝功能损伤。

为实现Tfh细胞体内靶向，研究团队在RLNP中引入不同比例的Tween-20。图G的活体成像显示，含0.7 mol% Tween-20的Tw/RLNP在注射后24小时于腹股沟淋巴结和肝脏区域呈现最强的荧光信号。图H-I的离体器官成像和定量分析证实，Tw/RLNP在淋巴结和肝脏的富集显著高于不含Tween-20的RLNP或其他比例组。图J的活体荧光定量进一步确认0.7 mol% Tween-20为最佳比例。

图K-L是关键证据：免疫荧光染色显示，Tw/RLNP递送的ΔLNGFR标记的CAR-Tfh细胞（红色）与CYP2D6+肝细胞（绿色）在肝组织中存在共定位，且ΔLNGFR+细胞面积与CYP2D6+面积呈正相关趋势。这表明CAR-Tfh能够迁移至肝脏并识别抗原表达的肝细胞。

CAR-Tfh疗法显著改善AIH-II小鼠病理并重塑免疫稳态

该图全面评估了Tw/RLNP介导的CAR-Tfh疗法在AIH-II模型中的治疗效果，并与临床常用免疫抑制剂进行了头对头比较。

图A-B的组织学染色显示，Tw/RLNP治疗组肝组织界面性肝炎、淋巴细胞浸润和胶原沉积显著减轻，而传统免疫抑制剂（泼尼松龙、布地奈德、硫唑嘌呤）组虽有改善但效果较弱。图C的CD4免疫荧光染色直观显示，Tw/RLNP治疗后肝内CD4+ T细胞浸润大幅减少。

流式细胞术定量分析（图D-F）表明，Tw/RLNP治疗显著降低了肝脏和脾脏中的CD4+ T细胞和B细胞绝对数量，而淋巴结中的细胞数量无显著变化，提示治疗主要作用于效应器官而非诱导器官。

图G-H的iNOS染色显示，Tw/RLNP治疗组肝脏中M1型巨噬细胞（iNOS+）显著减少，表明巨噬细胞介导的炎症反应受到抑制。图I进一步区分了CAR-Tfh与内源性Treg：在CD4+Foxp3+CXCR5+细胞中ΔLNGFR阳性率远高于CXCR5-细胞，证实CAR主要表达于Tfh样细胞。图J显示，CXCR5+PD-1+ΔLNGFR-的内源性Tfh细胞频率下降，提示致病性Tfh应答被抑制。

血清学检测（图K-M）显示，Tw/RLNP治疗后抗CYP2D6自身抗体（总IgG及各亚类）显著降低，促炎因子（IL-17、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α）下降，抗炎因子IL-10升高。

图N-R将Tw/RLNP与三种临床免疫抑制剂进行平行比较：H&E染色评分（图S）、血清ALT/AST水平（图O-P）、肝内Foxp3+ T细胞频率（图Q）和血清TNF-α水平（图R）均显示Tw/RLNP疗效最优。

图T-W为治疗后6周肝脏CD45+免疫细胞的单细胞测序分析。Umap聚类显示Tw/RLNP治疗后B细胞和浆细胞显著减少，而T细胞谱系整体保留（图V）。T细胞亚群分析（图U,W）显示，CD4+效应T细胞、Tfh和CD8+效应样细胞减少，而Foxp3+ Treg和耗竭性CD4+ T细胞（Tex）富集，提示免疫稳态的持久重塑。

主要结论

1.创新性LNP平台：基于色氨酸衍生的可电离脂质构建的LNPs，结合抗CXCR5抗体或Tween-20修饰，可实现Tfh细胞的高效体内靶向。

2.功能性CAR-Tfh：通过CD28 5‘UTR增强的saRNA共表达Foxp3和CYP2D6-CAR，使Tfh细胞获得抗原依赖性抑制功能，能有效抑制Tconv和B细胞增殖，并分泌TGF-β和IL-10。

3.显著疗效：在AIH-II小鼠模型中，单次Tw/RLNP静脉注射即可在淋巴结和肝脏生成CAR-Tfh，显著减轻肝损伤、降低自身抗体、抑制多种免疫细胞浸润，效果优于传统免疫抑制剂。

4.持久重塑：治疗后6周，肝脏免疫微环境呈现B细胞减少、Treg富集、耗竭T细胞增多的稳态特征。

局限性

尚未评估CAR-Tfh的长期安全性及潜在致瘤风险。

色氨酸衍生脂质是否直接参与免疫调节仍需进一步机制研究。

在更接近临床的自发性AIH模型中验证疗效尚待开展。

CAR-Tfh在人体Tfh细胞中的适用性及跨种属差异需评估。

文章：DOI: 10.1016/j.stem.2026.02.006